Team projects
Our integrative approach to understanding the bacterial, host and environmental factors associated with LD acquisition/severity is organized in two synergistic projects: (1) Bacterial determinants of Legionella-host cell interaction, and (2) Host, microbiota and environmental determinants of LD severity.
Axis1- Bacterial determinants of Legionella-host cell interaction
Project1-1. A FOCUS on Dot/Icm secretion
The T4SS Dot/Icm is recognized as a major virulence factor, by translocating ~330 effectors into the host cell, enabling bacterial intracellular multiplication in phagocytic cells, amoeba and human alveolar macrophages. Among the regulatory elements that control the expression of the Dot/Icm secretion system, we demonstrated the role of the Nucleoid-Associated-Proteins (NAP) Fis. Notably, Lp encodes 3 fis genes rather than the usual one. Fis1 and Fis2 cooperate to regulate virulence gene expression by targeting similar AT-rich motifs, albeit with distinct affinity, and by being capable of forming heterodimers (Andréa, bioRxiv 2024). We are now deciphering the structural and functional molecular basis of this control.
In addition to studying the regulation of Dot/Icm machinery and effectors synthesis, we showed that effectors translocation is orchestrated in a cyclic-diGMP dependent manner, and this control is required for efficient infection (Allombert, Infect. Immun 2014). By developing T4SS we demonstrated that translocation of each effector is accurately set up in time and correlated to its function during infection. We also found that one cyclic-diGMP metabolizing enzyme (out of 22 synthesized by Lp) locally controls the Dot/Icm machinery for appropriate delivery of effectors (Allombert, Jaboulay, J. Mol. Biol. 2021). We are now investigating the molecular mechanism by which c-di-GMP controls the T4SS machinery.
Besides exploring regulation of Dot/Icm secretion, we elucidated the function of several Dot/Icm effectors, and more recently, investigated inter-effector relationship. We demonstrated that the protein kinase LegK2 controls ARP2/3-mediated actin polymerization at the surface of the Legionella containing vacuole (LCV) (Michard, mBio 2015). We also defined the functional interactions between VipA and LegK2. Specifically, we demonstrated that LegK2/VipA effector pair target different substrates, ARP2/3 for LegK2 and G-actin for VipA, to temporally control actin polymerization at the LCV and interfere with phagosome maturation and endosome recycling (Pillon, Cellular Microbiology 2024). Now, rather than assessing the role of individual effectors, we are addressing their collective impact on the regulation of specific cellular functions. For instance, we are comprehensively defining the role of the five Dot/Icm effectors (LegK2, VipA, Ceg14, RavK, WipA) that targets the cell actin cytoskeleton. Moreover, we are conducting innovative screens using a proximity-labelling approach to study the localization of effectors within various cellular organelles and elucidate their functional contributions.
Project 1.2. Without « a priori » approach - Experimental evolution
We sought to characterize virulence factors without a priori by conducting experimental evolution strategies. After hundreds of generations without host cells, we identified one mutation that confers a strong attenuated virulent phenotype compared to the ancestral Lp virulent isolate. This modification consists in the integration of the endogenous plasmid pLPP into the chromosome. We demonstrated that plasmid integration and associated phenotypes can be reversed when bacteria were re-evolved in presence of amoebae, suggesting that the episomal form and/or the copy number of the plasmid confer a strong fitness advantage to bacteria and is essential for successful infections (Carrillo, in preparation). We are now performing functional investigations to decipher this novel regulatory pathway of Lp virulence.
Figure 2. Experimental evolution of L. pneumophila under various conditions and/or hosts.
Project 1.3. Role of c-di-GMP in the formation of persisters
Regarding bacterial determinants associated with slow- or non-resolving LD, we investigated the hypothesis that therapeutic failures could be due to Lp resistance to macrolides, the first-line therapy for LD treatment. We selected lineages of high-level macrolide-resistant Lp with mutations in 23S rRNA, L4 and L22 proteins (Descours, Antimicrob Agents Chemother 2017), and in non‑coding sequences upstream TolC-dependent efflux proteins encoding genes (Massip, J Antimicrob Chemother. 2017; Vandewalle-Capo, Int J Antimicrob Agents 2017). Yet, although macrolide-resistant strains have been recently identified in the environment (Portal, J Antimicrob Chemother 2021; Ginevra, J Antimicrob Chemother 2022), no clinical resistance has been reported, suggesting that recalcitrant LD is most likely due to Lp persisters (Pouderoux, Clin Infect Dis. 2020; Adams-Ward, Front Cell Infect Microbiol 2023). Our preliminary data suggest that host cell-derived NO regulates development of intracellular persisters in relation with a two-component regulatory system and c-di-GMP second messenger concentration.
In collaboration with N. Personnic, we are deciphering the molecular mechanism involved.
Axis 2- Host, microbiota and environmental determinants of LD severity
Projet 2.1. Role of c-di-GMP in the formation of persisters
Regarding bacterial determinants associated with slow- or non-resolving LD, we investigated the hypothesis that therapeutic failures could be due to Lp resistance to macrolides, the first-line therapy for L
Projet 3. Déterminants bactériens des Lp1 associés à une infection cellulaire humaine - une approche globale
Bien que la sécrétion Dot/Icm joue un rôle clé dans la virulence des légionelles, elle n’est pas suffisante pour expliquer la virulence variable observée entre les souches de Lp1. En effet, les gènes codant le système de sécrétion Dot/Icm sont très conservés quelle que soit la virulence des souches; et le niveau élevé de variabilité du répertoire des effecteurs Dot/Icm ne peut être mis en corrélation avec la variabilité de la virulence des souches. Par conséquent, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour identifier les déterminants bactériens associés à la sévérité de la légionellose. Nous développons trois approches complémentaires: des stratégies d'évolution expérimentale, le Tn-seq avec des cribles d’infection d’amibes et de cellules humaines de type sauvage ou inhibées / invalidées pour diverses voies (voies endocytiques, autophagiques, s
Projet 4. Déterminants bactériens, de l’hôte et du microbiote spécifique associés à la sévérité de la légionellose.
Notre objectif est d'étudier l'influence des déterminants bactériens et de l'hôte sur la gravité de la légionellose en analysant à la fois les données cliniques et les échantillons de patients prélevés au cours de l’infection. En ce qui concerne les aspects immunologiques, nous évaluons chez des patients présentant des profils de gravité opposés, les cellules impliquées dans la réponse immunitaire par immunophénotypage et par des tests fonctionnels ex vivo. L'impact de l'environnement microbien sur la virulence des légionelles sera également exploré à l'aide d'approches métagénomiques afin d'identifier une microflore spécifique qui pourrait être associée à la gravité de l'infection et aux modifications du microbiote associées à la progression de la maladie.
Projet 5. Déterminants ENvironnementaux de l'infection humaine et de la gravité de la légionellose.
Nous participons à un projet sur l'impact de la pollution par les particules fines de l'air extérieur sur la santé humaine (projet «Wanted» financé par le programme IDEX Breakthrough en 2018). L'OMS estime que 14% des décès prématurés liés à la pollution de l'air extérieur sont dus à une maladie pulmonaire obstructive chronique ou à des infections aiguës des voies respiratoires inférieures. Étant donné que (1) les légionelles sont des bactéries environnementales disséminées par des systèmes d'eau artificiels, (2) une inflammation plus importante est associée à la mortalité de ce pathogène, (3) l'exposition à des particules fines provoque des réactions pro-inflammatoires, nous étudierons l’impact de l'exposition aux particules fines sur le risque de développer une légionellose et sur la gravité de la maladie.