Soutenance de thèse Thibaut Halegua. Equipe REVE (09-12-2024)

Résumé: Le système CRISPR-Cas9 permet une modification ciblée du génome via une cassure double brin induisant des insertions ou délétions au locus cible. En revanche, le Prime Editing permet une réécriture précise du génome sans créer de cassure double brin, limitant ainsi les effets indésirables. Ce système repose sur une Cas9 nickase fusionnée à une rétrotranscriptase et un prime editor guide RNA (pegARN), qui combine à la fois la séquence de ciblage et de réécriture. Le prime editor et son guide ARN permettent d’introduire des mutations ponctuelles, des insertions ou des délétions avec une grande précision. Le Prime Editing est moins toxique et plus précis que CRISPR-Cas9, bien que son efficacité soit réduite. Sachant qu’environ 90 % des variants pathogènes répertoriés dans la base de données ClinVar sont des mutations ponctuelles, cela fait du Prime Editing une technologie de choix pour des applications en thérapie génique. Une question clé avant toute application ex-vivo ou in-vivo est la méthode de livraison des outils de thérapie génique. L’utilisation de particules pseudo-virales dérivées de rétrovirus pour la livraison de complexes ribonucléoprotéiques s’est largement démocratisée dans la dernière décennie, car elles permettent une édition rapide tout en réduisant les effets hors-cibles.

Dans cette thèse, nous avons développé une méthode de livraison du prime editor et de son pegARN sous forme de complexe ribonucléoprotéique via des particules pseudo-virales basées sur le virus de la leucémie murine. Pour cela, le variant prime editor 2 ou PEmax a été fusionné à la protéine GAG ainsi qu’à des séquences d’export nucléaire. Parallèlement, les pegARNs ont été stabilisés par l’ajout de la tige-boucle TAR du VIH-1 ainsi qu’un pseudonœud. Ces évolutions moléculaires ont permis d’atteindre des taux d’édition endogène compétitifs par rapport à ceux obtenus via une transfection classique. Cependant, le variant PEmax permet d’obtenir de meilleurs taux d’édition. Ensuite, l’encodage des pegARNs a été modifié pour être dépendant de la polymérase II grâce à des stratégies d’encodage intronique du guide. Ce qui a permis d’obtenir les meilleurs taux d’édition via la livraison avec les NanoScribes. Nous avons ensuite démontré que la livraison du complexe PEmax/pegARN par les NanoScribes est plus sécurisée que la transfection de matériel génétique codant ces éléments. Enfin, les NanoScribes permettent l’édition de cellules d’intérêt thérapeutique telles que les hiPSCs avec des taux satisfaisant sans contrevenir à la capacité de ces cellules à se différencier en motoneurones.

Mots-clés : VLP, Prime Editing, Livraison, Cellules souches, Edition génétique

Abstract: The CRISPR-Cas9 system enables targeted modification of the genome through double-strand breaks, resulting in insertions or deletions at the target locus. In contrast, Prime Editing allows for precise rewriting of the genome without creating double-strand breaks, thereby minimizing unwanted effects. This system is based on a Cas9 nickase fused to a reverse transcriptase and a prime editor guide RNA (pegRNA), which combines both the targeting and rewriting sequences. The prime editor and its guide RNA facilitate the introduction of point mutations, insertions, or deletions with high precision. Prime Editing is less toxic and more accurate than CRISPR-Cas9, although its efficiency is lower. Considering that approximately 90% of pathogenic variants listed in the ClinVar database are point mutations, Prime Editing is a key technology for gene therapy applications. A crucial question before any ex-vivo or in-vivo application is the delivery method for gene therapy tools. The use of pseudo-viral particles derived from retroviruses for the delivery of ribonucleoprotein complexes has become widespread in the last decade, as they enable rapid editing while reducing off-target effects.